DNA 감지 - 헝양레이저용접기그룹유한회사

Nature Biomedical Engineering (2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

단백질과 핵산 사이의 상호작용의 강도와 서열 특이성의 단일 분자 정량화는 단백질-DNA 결합의 조사를 촉진할 것입니다. 여기서 우리는 촉매적으로 비활성인 Cas9 리보핵산단백질과 미리 정의된 이중 가닥 DNA의 짧은 서열 사이의 결합 이벤트가 Cas9 결합 이중 가닥 DNA 돌출부가 전위되는 적절하게 설계된 바코드 선형 DNA 나노구조로서 이온 전류의 변화를 감지함으로써 식별될 수 있음을 보여줍니다. 고체 나노기공을 통해. 우리는 단일 뉴클레오티드 수준에서 Cas9의 DNA 서열과 DNA 결합 특이성, DNA 결합 효율 및 DNA 불일치 내성 사이의 관계를 연구하기 위해 바코드 DNA 나노구조를 설계했습니다. DNA 바코드 나노구조의 나노기공 기반 감지는 생물의학 응용을 위한 효율적이고 구체적인 리보핵단백질의 설계를 개선하는 데 도움이 될 수 있으며 민감한 단백질 감지 분석으로 개발될 수 있습니다.

단백질에 의한 핵산 서열의 인식은 생물학의 기본입니다. 단백질-DNA 결합의 특이성으로 인해 이러한 생체분자 간의 상호작용은 많은 바이오센싱 도구, 생체분자 공학 기술 및 새로운 치료법의 기초를 형성합니다1,2. 특히, CRISPR(Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat)/dCas9 시스템은 표적 유전자 발현 및 진단을 위한 강력한 도구로 등장했으며 현재 CRISPR/Cas3,4의 효율성과 특이성을 개선하기 위한 실질적인 작업이 진행되고 있습니다. 따라서 접힌 상태와 기능적 상태에서 핵산과 단백질 간의 상호 작용을 분석하여 기본 동작을 포착하는 간단하고 민감한 분석법을 개발하는 것이 필수적입니다. 또한, 이러한 방법론은 결합에 큰 영향을 미칠 수 있는 서열의 단일 뉴클레오티드 차이에 민감해야 합니다.

고체 나노기공을 이용한 저항성 펄스 감지는 결합 이벤트를 평가하는 매력적인 방법입니다. 이 기술은 단일 감지 시스템을 사용하여 원래 상태의 DNA, RNA 및 단백질을 연구할 수 있는 유연성을 제공합니다. 나노포어 감지는 적용된 전기장을 사용하여 분자가 나노미터 기공을 통해 구동될 때 이온 전류의 변화를 측정하는 데 의존합니다. 전좌로 인한 이온 전류 변화는 분자의 크기, 모양 및 전하를 반영합니다5. 나노기공에는 생물학적 및 고체형의 두 가지 유형이 있습니다. 생물학적으로 유래된 단백질 나노기공은 DNA 서열분석6에 이상적으로 적합하지만, 고체 나노기공은 제조 과정에서 기공 크기를 제어하여 광범위한 분석물질을 검출할 수 있습니다.

이러한 다재다능함은 다양한 생체분자의 분석을 허용하지만, 감지의 특이성 부족은 관심 대상을 쉽게 구별해야 하는 다중 검출에 대한 과제를 제시합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 관심 있는 단백질에 대한 특정 결합 부위를 포함하는 맞춤형 나노구조의 설계 및 조립을 가능하게 하는 DNA 나노기술을 활용합니다7.

이 기사에서는 일반적인 검출 도구로 사용하기 위해 나노피펫이라고도 알려진 석영 모세관을 당겨 고체 나노기공을 제조합니다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 나노포어 신호에 이온 전류 강하를 생성합니다. 단백질과 같은 분석물을 dsDNA에 결합하면 2차 전류 스파이크가 생성됩니다. DNA 가닥을 따라 특정 결합 부위나 서열을 설계함으로써 식별 가능한 패턴이 생성됩니다. 이 지문은 이온 전류의 스파이크에 대한 고유한 서명으로 관찰할 수 있습니다. 나노기공에서 표적화된 천연 DNA 서열의 라벨링 및 매핑은 이전에 펩타이드 핵산 프로브8,9, 생화학적 결찰10, 전사 인자11 및 메틸트랜스퍼라제 및 비오티닐화12를 이용한 화학적 변형을 포함한 다양한 방법을 사용하여 수행되었습니다. 최근 촉매적으로 불활성이거나 죽은 Cas9(dCas9)의 변이체가 dsDNA에 결합하는 것을 측정하기 위해 나노기공 분석을 사용하는 것이 입증되었습니다2,13 우리 시스템은 사용자를 위해 설계된 DNA 나노구조를 도입하여 이러한 초기 개념 증명 작업을 기반으로 합니다. DNA 표적 테스트를 정의하여 나노 기공 감지, DNA 나노 기술 및 단백질-DNA 상호 작용 스크리닝의 적용 공간을 확장합니다. 여기에서 우리는 신중하게 설계하고 테스트할 때 dCas9 복합체가 단일 염기쌍 변화를 결정하기 위해 매우 구체적인 DNA 매핑을 허용하는 표지 역할을 할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이는 진단에 특히 중요합니다4,14.

1016) molecules25. The number of multiplexed protein–DNA interactions is limited only by the number of nanopores and our ability to assemble these DNA nanostructures. In the sensing region of the nanostructure, two oligos were designed to create a dsDNA overhang that is 50 bp in length. This dsDNA overhang can present any DNA sequence of interest including target sequences for dCas9 binding./p> 65 events for each experiment. A control nanostructure with target DNA containing no PAM was also tested as seen in grey, where N > 165. Calculations were made using equations (1) and (2). c, Quantification of labelled events dependent on varying relative concentration ratio of DNA nanostructures (green or purple) in solution with equimolar concentrations of the two dCas9 probes (standard deviation represents one sample measured in at least two different pores). Calculations were made using equations (3–6). N > 85 events for each condition. Error bars represent standard deviation between nanopores. d, Reproduced experiments with 11001 and 11111 nanostructures barcode at a ratio of 2:1 in solution with equimolar concentrations of both dCas9 probes added. The different bars (1, 2 and 3) are three independent sample preparation repeats in three different nanopores. Calculations were made using equations (3–6). N > 100 events for each measurement. In all experiments, dCas9 probes were added in excess to target DNA molecules./p> 45 events for each experiment. Error bars are result of standard deviation from normalization to control binding efficiency./p> 45 events. d, Variations of probe 2 with mutations in gRNA. e, Comparison between predicted efficiency (grey) and measured binding efficiency when mutations are introduced into gRNA. Each experiment has at least greater than N > 55 events. f, Bar graphs with normalized binding ratios depicting probe dependence of GMT and large variation of binding among probes with introduced mutations. Each experiment has at least more than N > 55 events./p>15 pA are discarded. The parameters to find the spikes are based on manual analysis of the threshold, height, distance and prominence parameters from the Python peakfinder package. This is tested on the first ten and last ten events to ensure the parameters are consistent and will accurately find the peaks. Following this, events are sorted on the basis of the number of spikes. Following the sorting, the events are analysed by eye and events that have folds or knots interfering with the barcode are discarded. Our lab has shown that as few as four events are sufficient for positive detection in the majority of cases, while nine correct events increase the probability of positive detection to more than 90% (ref. 46). Percentage of events with dCas9 bound in Figs. 2b and 4 is calculated the following way:/p>